盡管科學(xué)家們?nèi)圆煌耆私釸NA分子的多樣性，但據(jù)信與它們結(jié)合的蛋白稱為RNA結(jié)合蛋白，與多種疾病形成有關(guān)。香港城市大學(xué)(CityU)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)的研究導(dǎo)致了一種名為CARPID的新型檢測(cè)方法，該方法可鑒定活細(xì)胞中特定RNA的結(jié)合蛋白。有望將該創(chuàng)新技術(shù)應(yīng)用于各種類型的細(xì)胞研究，從鑒定癌癥診斷的生物標(biāo)志物到檢測(cè)治療病毒性疾病的潛在藥物靶標(biāo)。

這項(xiàng)研究由城大生物醫(yī)學(xué)系(BMS)的嚴(yán)堅(jiān)博士，張亮博士和陳奎明博士與西安西北大學(xué)的科學(xué)家共同領(lǐng)導(dǎo)。一個(gè)。他們的發(fā)現(xiàn)發(fā)表在科學(xué)雜志《自然方法》上，標(biāo)題為“ CRISPR輔助檢測(cè)活細(xì)胞中RNA-蛋白質(zhì)相互作用”。

結(jié)合蛋白決定RNA功能

分子生物學(xué)的中心教條表明，DNA被轉(zhuǎn)錄為RNA，RNA被翻譯為蛋白質(zhì)。但實(shí)際上，只有大約2%的RNA編碼蛋白質(zhì)。其余98%的非編碼RNA(ncRNA)因其神秘的功能而被視為“暗物質(zhì)”。

近年來(lái)，科學(xué)家付出了很多努力來(lái)揭示RNA的實(shí)際功能，尤其是長(zhǎng)的非編碼RNA(lncRNA，即長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的ncRNA)。LncRNA已被廣泛接受為參與基因表達(dá)調(diào)控的重要細(xì)胞成分。嚴(yán)博士說(shuō)：“ LncRNA是最有趣的RNA種類。”這也是該團(tuán)隊(duì)選擇lncRNA作為研究對(duì)象的原因。

盡管lncRNA不產(chǎn)生蛋白質(zhì)，但它們將與蛋白質(zhì)反應(yīng)，相互作用將決定其功能。因此，結(jié)合蛋白的鑒定對(duì)于理解lncRNA功能至關(guān)重要。然而，當(dāng)前的方法表現(xiàn)出許多局限性，例如產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)，并且不能在活細(xì)胞中完成。

CARPID的兩個(gè)步驟：導(dǎo)航和生物素標(biāo)記

為了克服現(xiàn)有方法的局限性，研究團(tuán)隊(duì)提出了一種新穎的方法，該方法可以聯(lián)合利用現(xiàn)有的最新基因編輯技術(shù)CRISPR / dCasRx系統(tǒng)進(jìn)行RNA靶向，并采用鄰近生物素標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行鑒定活細(xì)胞中蛋白質(zhì)之間的相互作用。

該團(tuán)隊(duì)將新方法命名為CARPID，它是CRISPR輔助RNA-蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)的縮寫(xiě)。嚴(yán)博士說(shuō)：“ CARPID可以靈敏地檢測(cè)任何長(zhǎng)度或濃度的RNA結(jié)合蛋白，而大多數(shù)其他方法只能應(yīng)用于很長(zhǎng)的非編碼RNA。”

該方法由兩部分組成：導(dǎo)航和鄰近生物素標(biāo)記。首先，該團(tuán)隊(duì)采用CRISPR / CasRx系統(tǒng)進(jìn)行導(dǎo)航，以便CARPID組件(包括稱為BASU的“標(biāo)記工具”)可以接近目標(biāo)RNA。BASU是一種工程化的生物素連接酶，是一種將生物素(一種具有強(qiáng)結(jié)合力的維生素)添加到與目標(biāo)RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)上的酶。以此方式，將標(biāo)記接近靶RNA的那些蛋白質(zhì)。

標(biāo)記后，研究小組隨后使用一種稱為鏈霉親和素的生物素結(jié)合蛋白來(lái)鑒定那些被BASU標(biāo)記的蛋白。這樣，結(jié)合蛋白容易被揭示。

對(duì)不同長(zhǎng)度的lncRNA具有高度的特異性和適用性

為了測(cè)試CARPID的特異性，研究小組將其應(yīng)用于三種不同的lncRNA，即DANCR，XIST和MALAT1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明結(jié)合蛋白沒(méi)有太多的重疊。這證明了CARPID方法對(duì)不同長(zhǎng)度和表達(dá)水平的lncRNA的高度特異性和適用性。

嚴(yán)博士解釋說(shuō)：“之所以能達(dá)到如此高的特異性，是因?yàn)镃RISPR的導(dǎo)航非常精確。我們甚至可以準(zhǔn)確地獲得蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)生在RNA哪一部分的信息。”

同樣，CARPID不會(huì)影響目標(biāo)細(xì)胞的生理狀況，并且在整個(gè)過(guò)程之后，該細(xì)胞仍然活著并具有正常的基因表達(dá)格局。張博士補(bǔ)充說(shuō)：“通過(guò)這種新方法，如果我們?cè)诓煌瑫r(shí)間檢查相同的RNA靶標(biāo)，我們可以獲得動(dòng)態(tài)結(jié)果。”

在張博士開(kāi)發(fā)的蛋白質(zhì)組學(xué)(蛋白質(zhì)分析)技術(shù)的支持下，該團(tuán)隊(duì)能夠發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證哺乳動(dòng)物細(xì)胞中l(wèi)ncRNA的兩個(gè)先前未表征的結(jié)合蛋白。

病毒RNA結(jié)合蛋白的檢測(cè)

該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為CARPID具有廣泛的應(yīng)用，包括檢測(cè)病毒RNA的結(jié)合蛋白。“例如，SARS-CoV-2是一種引起COVID-19的RNA病毒。一旦病毒感染細(xì)胞，我們就可以應(yīng)用CARPID來(lái)檢測(cè)該病毒在病毒生命周期中募集的細(xì)胞蛋白。如果我們消除了這種結(jié)合，蛋白質(zhì)，我們很可能會(huì)抑制病毒的復(fù)制。這些信息可能有助于我們確定潛在的抗病毒藥物靶標(biāo)。”

此外，許多l(xiāng)ncRNA被用作癌癥的診斷生物標(biāo)志物，因?yàn)樗鼈冊(cè)诎┘?xì)胞中比正常細(xì)胞變得更加豐富。CARPID可用于檢測(cè)癌細(xì)胞中這些lncRNA 的結(jié)合蛋白，這可能有助于尋找致癌機(jī)制和潛在的蛋白靶標(biāo)，用于癌癥的診斷或治療。

團(tuán)隊(duì)花了大約一年的時(shí)間開(kāi)發(fā)CARPID，并且大部分實(shí)驗(yàn)都是在CityU進(jìn)行的。他們的下一步將嘗試將其應(yīng)用于干細(xì)胞和DANCR(一種通常用作腫瘤啟動(dòng)子的lncRNA)的研究。